La contaminazione microbica: una, nessuna e centomila

Riassunto

Introduzione
Per una banca degli occhi, lo studio approfondito della contaminazione microbiologica delle cornee rappresenta una priorità, contribuendo a minimizzare sia il rischio di infezione dopo il trapianto, che il numero di cornee scartate. L’obiettivo è analizzare la percentuale di contaminazione delle cornee conservate in coltura d’organo e l’evoluzione della tipologia dei microrganismi coinvolti in relazione a diversi possibili fattori di rischio. Sono stati presi in considerazione il sesso del donatore, la causa di morte, il reparto di decesso, la temperatura media.

Materiali e metodi
I dati sono stati raccolti nel periodo 2016-2024 presso la Banca degli occhi della Regione Piemonte e Valle d’Aosta, in collaborazione con il Laboratorio di Microbiologia e Virologia della CDSS di Torino.

Risultati
Delle 13889 cornee prelevate, 289 sono state scartate perché positive ai controlli microbiologici post-coltura, con una percentuale di contaminazione media annuale del 4% sul totale delle cornee conservate (intervallo 2,8%-6,2%). I principali contaminanti erano batteri gram-negativi prevalentemente multiresistenti (Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas), funghi lievitosimili (Candida spp.), batteri gram-positivi (Enterococcus, Staphylococcus spp., Corynebacterium striatum) e funghi filamentosi (Aspergillus). Nel triennio post-Covid il quadro dei microrganismi coinvolti è evoluto verso una predominante contaminazione fungina. Tra le cause di morte la neoplasia è associata ad un tasso di contaminazione più elevato. Una più alta contaminazione si rileva nei tessuti prelevati nelle Rianimazioni e nelle Oncologie. Nel 2022 e nel 2023, che rappresentano gli anni più caldi, sono stati registrati i più alti tassi di contaminazione (rispettivamente 6,1% e 5,3%). Nell’intero periodo considerato, giugno e luglio registrano un significativo incremento della percentuale media di contaminazione corneale che sale dal 4% al 14%.

Conclusioni
L’origine della contaminazione microbica nelle cornee conservate in coltura d’organo sembra essere multifattoriale e potrebbe essere influenzata dal reparto di decesso del donatore, dalla causa di morte e dalla temperatura media mensile e annuale.

La contaminazione microbica rappresenta una realtà complessa e multiforme, in costante cambiamento e suggerisce più di una riflessione sull’intero processo donazione-trapianto.

Le Banche degli occhi selezionano e distribuiscono i tessuti corneali prelevati dopo averli selezionati e conservati utilizzando 2 metodi: la conservazione ipotermica (2°C – 8°C) principalmente utilizzata negli Stati Uniti e la coltura d’organo (31°C – 37° C), utilizzata nella maggior parte delle banche europee fin dagli anni ’70 del secolo scorso (1-4). Oltre a permettere il mantenimento del tessuto per un periodo prolungato (fino a 35 giorni rispetto ai 14 giorni della conservazione a freddo) (5,6) e una maggiore disponibilità di tessuti anche per interventi urgenti, la conservazione in coltura d’organo offre l’opportunità di rilevare la contaminazione microbica del tessuto durante le fasi successive della conservazione (7,8), garantendo maggiore qualità e sicurezza prima della distribuzione al chirurgo. Quando una contaminazione viene rilevata dai test microbiologici effettuati durante il periodo di conservazione, o semplicemente dal viraggio del colore del terreno di conservazione, il tessuto viene scartato per evitare qualsiasi rischio di infezione post-operatoria. La cheratite infettiva è infatti una delle complicazioni della cheratoplastica più temute, portando con sé un grande rischio di fallimento del trapianto (9-11) e un aumentato rischio di endoftalmite, che può portare alla perdita dell’occhio del ricevente (12-16).

Si valuta che il rischio di endoftalmite aumenta significativamente quando gli organismi contaminanti vengono trasmessi attraverso il trapianto di cornea (13,14).
Dati bibliografici evidenziano che la percentuale di contaminazione microbica delle cornee conservate in coltura d’organo varia dallo 0,53% al 15,7% (17,18).
Questo ha suggerito l’implementazione di diverse procedure per minimizzare il rischio di contaminazione delle cornee prelevate: da un’attenta selezione del donatore, a una accurata disinfezione prima del prelievo oltre ovviamente a una manipolazione dei tessuti in condizioni di asepsi e all’aggiunta di antibiotici e antifungini nei terreni di conservazione (19,20).
Diversi fattori come l’età del donatore (19), la causa di morte (24), il tempo intercorso tra la morte e il prelievo e il tempo dalla morte alla processazione (21-23) così come diverse tecniche di prelievo e conservazione (4,20,25) e la sepsi del donatore (24) sono stati analizzati riguardo alla loro influenza sulle contaminazioni delle cornee dei donatori, con risultati spesso controversi.
Valutare la percentuale di contaminazione microbica come indicatore di qualità ci ha portato ad osservare un lieve ma costante aumento della percentuale di tessuti scartati per controlli microbiologici positivi.
L’obiettivo del nostro studio è valutare, nel corso di un ampio periodo (2016-2024) la percentuale di contaminazione microbica delle cornee conservate in coltura d’organo presso la Banca degli occhi della Regione Piemonte e Valle d’Aosta e analizzare l’evoluzione e le sensibilità agli antibiotici delle specie di microrganismi coinvolti. Sono stati esaminati fattori quali il sesso e l’età del donatore, la causa di morte, l’intervallo post-mortem, il reparto di decesso e la temperatura media mensile e annuale.

MATERIALI E METODI

Processazione delle cornee
Abbiamo analizzato retrospettivamente i dati riguardanti tutte le cornee prelevate e conservate in coltura d’organo tra il 1° gennaio 2016 e il 31 dicembre 2024 presso la Banca degli occhi della Regione Piemonte e Valle d’Aosta. Le due cornee di un singolo donatore sono state incluse indipendentemente. I donatori sono stati selezionati in accordo alla normativa e alle linee guida italiane ed europee. Dopo escissione delle cornee in situ entro 24 ore dal decesso e trasferimento in un mezzo di prelievo e trasporto (Eusol-C; Alchimia) i tessuti sono valutati al microscopio ottico mediante colorazione vitale con trypan blue (Meran; 0,25%, Capsule Dye) e conservati successivamente in 100 mL di terreno di conservazione (Tissue-C; Alchimia). Dopo un periodo di quarantena a 31°C, durante il quale sono eseguiti tutti i controlli microbiologici previsti, le cornee sono sottoposte ad un ulteriore controllo di qualità per valutarne l’idoneità biologica prima della distribuzione. Prima di essere resa disponibile per il trapianto la cornea è trasferita in 50 mL di terreno di trasporto contenente destrano (Carry-C; Alchimia), sul quale si esegue un ulteriore test microbiologico a garanzia della sicurezza del tessuto. I terreni di conservazione e di trasporto contengono entrambi penicillina e streptomicina come antibatterici e amfotericina B come antimicotico.

Rilevazione della contaminazione
I terreni di conservazione sono periodicamente controllati per valutare eventuali segni macroscopici di contaminazione come torbidità e viraggio del colore.
I test microbiologici sono eseguiti dopo 7 giorni dall’inizio della conservazione sul terreno di conservazione utilizzando flaconi per emocoltura per la rilevazione di microrganismi aerobi e anaerobi/anaerobi facoltativi (BioMerieux; BacT/ALERT 3D). Ciascun flacone viene inoculato con circa 4 mL di terreno di coltura e tenuto in osservazione per un periodo di 5 giorni presso il Laboratorio di Microbiologia della S.C. Microbiologia e Virologia della A.O.U. Città della Salute e della Scienza di Torino. In caso di positività, si procede con l’identificazione dei microrganismi contaminanti e la cornea viene scartata. Se le caratteristiche di idoneità del tessuto sono soddisfatte, la cornea viene trasferita nel terreno di trasporto e prima della distribuzione viene eseguito un test microbiologico rapido per la rilevazione della crescita di aerobi, anaerobi e miceti che fornisce i risultati entro 24 ore (Alifax; HB&L). In caso di positività dopo la distribuzione il chirurgo viene tempestivamente informato dell’identificazione del microrganismo contaminante e del relativo antibiogramma.

Valutazione
Sono stati raccolti dati relativi all’età e al sesso del donatore, alla causa di morte, all’intervallo decesso-prelievo, al reparto di decesso.
La percentuale media di contaminazione delle cornee di ciascun anno è stata sovrapposta ai dati delle temperature medie annuali di Torino scaricati dalla homepage del servizio italiano di meteorologia, per indagare la possibilità che i recenti cambiamenti climatici possano influenzare la percentuale di contaminazione delle cornee.
Inoltre, i dati di contaminazione microbica corneale dell’intero periodo sono stati suddivisi per singolo mese per valutare se anche le variazioni stagionali della temperatura possano determinare variazioni nel tasso di contaminazione microbica.
Sono stati identificate le specie di microrganismi contaminanti e analizzate le rispettive sensibilità agli antibiotici.
I dati sono stati poi elaborati suddividendo il periodo d’analisi in due quadrienni per valutare se la pandemia SARS-CoV-2 ha influito sulla contaminazione delle cornee prelevate.

RISULTATI

Un totale di 13889 cornee è stato incluso nello studio. 8171 cornee (58,8%) sono state prelevate da donatori maschili, mentre 5718 cornee (41,2%) sono state prelevate da donatori femminili.
Di tutte le cornee prelevate, 289 sono risultate positive. Il tasso di contaminazione annua è stato del 4% (intervallo: 2,8% - 6,1%) (figura 1).

Nel 47,2% dei casi, entrambe le cornee dello stesso donatore erano contaminate, mentre il 52,8% delle contaminazioni si è verificato solo in una cornea del rispettivo donatore.
Delle 289 contaminazioni totali, il 54.3% è stato causato da batteri, prevalentemente gram negativi, il 42,6 da funghi, prevalentemente lievitosimili, e il 3,1% dei contaminanti non è stato identificato (tabella 1).

Nel periodo considerato (2016-2024) i donatori sono stati selezionati prevalentemente nei reparti di Anestesia e Rianimazione (43,7%; n = 6064), seguiti dalle Medicine (30,8%; n = 4280), dalle Oncologie (16,8%; n = 2338) e da altre tipologie di reparti (8,7%; n = 1207).
La principale causa di morte è rappresentata dalle patologie neoplastiche (37,0%), seguita dalle infettive (16%), dalle cardiovascolari (15%), dalle cerebrovascolari (10%), dalle respiratorie (9%) e dalle cause di morte traumatiche (7%).

Dalla distribuzione delle contaminazioni microbiche per causa di morte (figura 2) si evidenzia che le patologie infettive non aumentano il rischio di contaminazione delle cornee conservate in coltura d’organo. Le cornee prelevate da donatori neoplastici
mostrano invece apparentemente una percentuale più elevata di contaminazione microbica. I dati dovranno essere confermati da studi più approfonditi.

Per valutare se i cambiamenti di temperatura stagionali corrispondono ai tassi di contaminazione, abbiamo calcolato il tasso medio di contaminazione annuale e la temperatura media annuale di tutti gli anni. Considerando la tendenza del cambiamento climatico e le temperature medie annuali, si evidenzia che gli anni in cui si sono registrati i più alti tassi di contaminazione sono gli anni più caldi dell’intero periodo, ovvero il 2022 e il 2023 (contaminazione rispettivamente del 6,1% e del 5,4%) (figura 3).

È stato poi calcolato il tasso medio di contaminazione mensile di tutti gli anni. I mesi di giugno e luglio che rappresentano i mesi più caldi dell’anno sono quelli in cui si registrano le percentuali di contaminazioni più elevate, fino a raggiungere un tasso del 14%.
Abbiamo indagato se la pressione sociale e sanitaria dovuta alla pandemia da Covid abbia influenzato il processo, suddividendo il periodo in esame in 2 quadrienni pre-SARS-CoV-2 e post-SARS-CoV-2: il primo dal 2016 al 2019 e il secondo dal 2020 al 2023 (tabella 2).

In quest’ultimo periodo si è registrata una percentuale di cornee per microbiologia positiva dopo conservazione in coltura d’organo significativamente più alta rispetto al periodo precedente (figura 4).

Dall’elaborazione dei dati è interessante notare come nel corso degli anni l’evoluzione delle contaminazioni microbiche sia evoluta verso una prevalenza di funghi, evidenziando nel 2024 una netta riduzione delle contaminazioni batteriche rispetto agli anni precedenti in contrapposizione ad un drastico incremento delle contaminazioni fungine che sono più che raddoppiate in termini percentuali rispetto al periodo 2016-2023 (figura 5).

La maggior parte delle contaminazioni batteriche è dovute a microrganismi con uno spettro di resistenza a diversi antibiotici testati (tabella 3, 4).

Tra i contaminanti fungini la Candida glabrata e la Candida krusei mostrano uno spettro di resistenza o di sensibilità intermedia a diversi tipi di antimicotici testati. Candida albicans e Candida parapsilosis sono invece sensibili all’amfotericina B (tabella 5).

CONCLUSIONI

La contaminazione microbica è un indicatore importante nel processo donazione-trapianto. La percentuale di contaminazione media annuale registrata tra il 2016 e il 2024 presso la Banca degli occhi della Regione Piemonte e Valle d’Aosta era del 4%. Negli ultimi anni del periodo analizzato si è notato un lieve ma costante aumento nella percentuale di contaminazione delle cornee conservate in coltura d’organo. Si noti che non ci sono stati cambiamenti nelle tecniche di approvvigionamento o di processazione dei tessuti durante questo periodo che potrebbero spiegare queste variazioni.
Di tutte le contaminazioni, il 51 % era monolaterale, il 49% bilaterale.
Per quanto riguarda il profilo dei donatori delle cornee contaminate, le cause di decesso più frequenti erano le patologie neoplastiche e infettive, seguite dalle cardiovascolari, cerebrovascolari, respiratorie, traumi e altre. Dai dati elaborati durante il nostro studio si evidenzia una più alta percentuale di contaminazione delle cornee provenienti da donatori neoplastici, a differenza delle patologie infettive che non sembrano essere correlate ad un rischio maggiore.
Oltre il 50% delle contaminazioni era dovuto a batteri, prevalentemente gram-negativi, oltre il 40% erano funghi, lievitiformi e filamentosi. I principali contaminanti sono Enterococcus e Staphylococcus tra i gram positivi; Acinetobacter, Klebsiella e Pseudomonas tra i gram negativi. Tra i funghi lievitosimili prevalgono le Candide (in primis albicans e glabrata), seguiti da Aspergillus e Penicillium come funghi filamentosi.
A differenza dei miceti generalmente sensibili alla maggior parte degli antimicotici testati (ad eccezione della C. glabrata e della C. Krusei) il profilo degli antibiogrammi mostra un quadro di batteri tendenzialmente multiresistenti. Questo dato sembra essere in relazione al reparto di decesso del donatore: il reparto di decesso da cui più frequentemente provenivano le cornee contaminate era la rianimazione, seguito dall’oncologia e dalla medicina. I dati rilevati potrebbero portare ad ipotizzare un cambiamento nei percorsi e nei protocolli di cura dei donatori.
A rafforzare questa ipotesi si riportano i risultati ottenuti suddividendo il periodo in esame in 2 quadrienni pre- e post- pandemia SARS-CoV-2. La pandemia ha infatti determinato un cambiamento importante nell’organizzazione sanitaria e di conseguenza ha segnato in modo forte anche il processo donazione-trapianto. Dall’elaborazione dei dati è interessante notare come nel corso degli anni l’evoluzione delle contaminazioni microbiche sia evoluta verso una prevalenza di funghi. Nel secondo quadriennio si è infatti evidenziata una riduzione significativa delle contaminazioni batteriche rispetto ai 4 anni precedenti, in contrapposizione ad un incremento delle contaminazioni fungine. Nel 2024 le contaminazioni fungine sono ulteriormente aumentate, raggiungendo valori più che raddoppiati in termini percentuali rispetto al periodo complessivo.
Inoltre, è interessante notare come il cambiamento climatico possa avere influenza sulla contaminazione microbica delle cornee in coltura. Infatti, i tassi di contaminazione più alta sono stati registrati negli anni con temperature medie più elevate. Una correlazione tra il tasso di contaminazione microbica e le temperature esterne è evidente anche considerando che, nel periodo considerato in questo studio, si sono registrati incrementi significativi di contaminazione proprio nei mesi di giugno e luglio, i più caldi dell’anno.

L’autore dichiara l’assenza di conflitti di interesse.