Riassunto
Cosa possono rivelare le lacrime sulla nostra salute? Oltre a essere il nostro modo naturale di esprimere emozioni e proteggere gli occhi, le lacrime contengono preziose informazioni biologiche, anche oltre la sola diagnostica di malattie della superficie oculare.
Negli ultimi anni, i microRNA (miRNA) presenti nel film lacrimale si sono rivelati potenziali biomarcatori per diverse patologie oculari e sistemiche. Grazie ai progressi nelle tecniche di rilevazione e all’analisi bioinformatica, è oggi possibile studiare i miRNA anche in campioni di volume ridotto come le lacrime. In questo contributo, esploriamo il ruolo dei miRNA lacrimali in malattie come sindrome dell’occhio secco, sindrome di Sjögren, glaucoma, retinopatia diabetica, Alzheimer e carcinoma mammario metastatico. Analizziamo inoltre i vantaggi della diagnostica non invasiva basata sulle lacrime e le prospettive per una medicina sempre più personalizzata. Nonostante i risultati promettenti, restano fondamentali studi standardizzati e su larga scala per confermarne l’affidabilità clinica.
In questo contributo ci occupiamo di microRNA (miRNA), i quali stanno emergendo come potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici, e per la cui scoperta gli scienziati Victor Ambros e Gary Ruvkun hanno vinto il Premio Nobel per la Medicina 2024. Queste piccole sequenze di RNA non codificante, costituite da circa una ventina di nucleotidi, regolano numerosi processi cellulari, tra cui infiammazione, metabolismo e omeostasi, e il loro ruolo nella fisiopatologia oculare è sempre più oggetto di studio. Una parte significativa dei miRNA nelle lacrime è veicolata da vescicole extracellulari (EV), nanoparticelle di membrana che facilitano la comunicazione intercellulare e proteggono i miRNA dalla degradazione enzimatica (fig. 1). Le EVs nel film lacrimale derivano da cellule della ghiandola lacrimale, congiuntiva e cornea, riflettendo lo stato fisiologico e patologico dell'occhio.
Fig. 1 Ruolo degli esosomi e dei microRNA nel trasporto intercellulare e nella modulazione fenotipica.
1. Secrezione: le cellule di origine rilasciano vescicole extracellulari (come gli esosomi) contenenti vari componenti molecolari, inclusi microRNA (miRNA), mRNA, proteine, lipidi e DNA.
2. Captazione: le cellule riceventi, tramite endocitosi o fusione di membrana, incorporano queste vescicole. I miRNA rilasciati nel citoplasma possono modulare l'espressione genica, inibendo la traduzione degli mRNA bersaglio.
3. Alterazione fenotipica: nei casi in cui i segnali molecolari trasferiti influenzino la morfologia, il citoscheletro, la secrezione o altre funzioni cellulari, si verifica una modifica fenotipica della cellula ricevente, potenzialmente patologica.
4. Effetto terapeutico: in cellule patologiche, l’introduzione di esosomi contenenti miRNA regolatori può ripristinare un fenotipo normale, aprendo prospettive terapeutiche per malattie infiammatorie, degenerative o tumorali.
Grazie ai progressi nelle tecniche di sequenziamento e all'uso di strumenti bioinformatici avanzati, è oggi possibile analizzare i miRNA anche in fluidi biologici di limitato volume come appunto le lacrime. Questa nuova prospettiva apre la strada a una diagnostica più raffinata e meno invasiva, con potenziali e significative implicazioni cliniche. In particolare, studi recenti hanno evidenziato un'alterazione del profilo dei miRNA lacrimali in diverse patologie oculari, tra cui la sindrome dell’occhio secco, la sindrome di Sjögren, la cheratite, la cheratocongiuntivite vernal, il glaucoma, l’edema maculare diabetico e la retinopatia diabetica. Ma l’interesse per i miRNA lacrimali non si limita alle sole patologie oftalmiche. È stato infatti dimostrato che alcune di queste molecole possono essere correlate a condizioni sistemiche come il morbo di Alzheimer e alcuni tipi di neoplasie. Questo suggerisce un possibile ruolo delle lacrime come finestra privilegiata per la valutazione dello stato di salute generale del paziente .
I geni dei microRNA vengono trascritti nel nucleo come trascritti primari (pri-miR), che presentano strutture a forcina. Il complesso microprocessatore contenente l'enzima Drosha cliva il pri-miR per generare un precursore a forcina (pre-miR), che viene successivamente esportato nel citoplasma. Qui, l'enzima Dicer elabora ulteriormente il pre-miR per produrre una molecola duplex di RNA. Uno dei due filamenti, il microRNA maturo (miR), viene caricato nel complesso RISC (RNA- complesso di silenziamento indotto da RNA), dove può guidare il riconoscimento di mRNA bersaglio, inducendone la degradazione o la repressione della traduzione. Il filamento complementare (miR*) viene invece degradato (fig. 2).
Fig. 2 Il processo di biogenesi dei microRNA
MicroRNA: piccole molecole, grande impatto
All'interno delle cellule, gli RNA messaggeri (mRNA) sono responsabili del trasporto delle informazioni necessarie alla sintesi delle proteine, fondamentali per il funzionamento dell’organismo. Accanto a questi, esiste un'ampia categoria di RNA non codificanti, che per lungo tempo è stata considerata di scarsa importanza. Oggi, invece, sappiamo che questi RNA, che costituiscono circa il 98% del genoma trascritto, svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dei processi cellulari.
Tra gli RNA non codificanti, i microRNA (miRNA) sono tra i più studiati. Si tratta di brevi sequenze di RNA (circa 20 nucleotidi) che regolano l’espressione genica legandosi agli mRNA, influenzandone la stabilità e impedendo la produzione di specifiche proteine. Questo meccanismo di controllo è essenziale per il mantenimento dell’equilibrio cellulare, influenzando crescita, differenziazione e sopravvivenza delle cellule.
I miRNA seguono una nomenclatura standardizzata che ne facilita l’identificazione e il confronto tra specie diverse. Ogni microRNA maturo è indicato con la sigla “miR” seguita da un numero progressivo, assegnato in base all’ordine di scoperta, senza un significato funzionale. Quando è necessario specificare il filamento del precursore da cui deriva, si aggiunge il suffisso -5p o -3p. Per distinguere la specie di origine, si usa un prefisso, come hsa- per l’essere umano.
Un'alterazione dei livelli di miRNA può essere alla base di numerose patologie, tra cui tumori, malattie cardiovascolari, neurodegenerative e autoimmuni. Alcuni miRNA, infatti, possono favorire la proliferazione delle cellule tumorali (oncogeni), mentre altri possono inibire la crescita del tumore (oncosoppressori). Questa scoperta ha aperto nuove prospettive per lo sviluppo di terapie mirate basate sui miRNA.
Le ricerche attuali stanno esplorando due strategie principali per utilizzare i miRNA in ambito terapeutico:
- ripristinare la funzione dei miRNA mancanti o ridotti, utilizzando molecole sintetiche che ne imitano l’azione;
- bloccare i miRNA iperattivi, attraverso antagonisti specifici che ne limitano l’effetto, riducendo le conseguenze dannose della loro eccessiva espressione.
Sebbene questi approcci siano ancora in fase sperimentale, il loro potenziale è significativo e potrebbe rivoluzionare il trattamento di molte patologie in futuro.
Il processo di biogenesi
I geni dei microRNA vengono trascritti nel nucleo come trascritti primari (pri-miR), che presentano strutture a forcina. Il complesso microprocessatore contenente l'enzima Droshacliva il pri-miR per generare un precursore a forcina (pre-miR), che viene successivamente esportato nel citoplasma. Qui, l'enzima Dicer elabora ulteriormente il pre-miR per produrre una molecola duplex di RNA. Uno dei due filamenti, il microRNA maturo (miR), viene caricato nel complesso RISC (RNA- complesso di silenziamento indotto da RNA), dove può guidare il riconoscimento di mRNA bersaglio, inducendone la degradazione o la repressione della traduzione. Il filamento complementare (miR*) viene invece degradato.
Come si studiano i miRNA
Lo studio dei miRNA prevede un approccio integrato che combina metodiche sperimentali e analisi bioinformatiche. L’isolamento dell’RNA totale da tessuti o fluidi biologici viene seguito dalla retrotrascrizione specifica dei miRNA e dalla loro quantificazione tramite RT-qPCR, considerata il gold standard per l’analisi mirata. Per il profiling globale, si ricorre a tecniche ad alta processività come il microarray o il sequenziamento di nuova generazione (next-generation sequencing, NGS), che consentono l’identificazione di miRNA noti e la scoperta di nuove sequenze. L’interpretazione dei dati si avvale di strumenti bioinformatici per l’analisi dell’espressione e la predizione dei target genici. Studi funzionali, mediante gain- o loss-of-function, sono essenziali per validare il ruolo dei miRNA nei processi fisiopatologici.
MiRNA come biomarcatori nelle malattie oculari
Rispetto ad altri biofluidi come sangue, siero, liquido cerebrospinale, saliva e liquido sinoviale, il numero di studi sui miRNA del film lacrimale è ancora limitato. Tuttavia, grazie ai recenti progressi nei metodi di rilevazione e negli strumenti bioinformatici, cresce l’interesse per il loro studio, poiché i miRNA lacrimali presentano stabilità extracellulare, specificità tissutale e capacità di regolazione post-traduzionale. Diversi studi hanno dimostrato che i livelli di specifici miRNA nel fluido lacrimale variano in relazione a diverse condizioni patologiche, ecco di seguito una brevissima raccolta di evidenze.
Sindrome dell’occhio secco (DED)
Ad oggi, solo pochi studi hanno analizzato il profilo dei miRNA nelle lacrime di pazienti con DED. Due ricerche hanno identificato specifici miRNA associati alla malattia: il primo studio ha evidenziato l’aumento di nove miRNA legati all’infiammazione, mentre il secondo ha trovato quattro miRNA sovraregolati e ben 28 miRNA sottoregolati rispetto ai soggetti sani. Tuttavia, i risultati di questi studi non coincidono, probabilmente a causa delle diverse metodologie utilizzate, dei metodi di raccolta delle lacrime e delle dimensioni del campione analizzato. Alcuni miRNA identificati nella DED sono già noti per il loro coinvolgimento in altre condizioni, come il cancro e l’infiammazione cronica. Ad esempio, il miR-203 è stato associato all’omeostasi oculare e alla risposta infiammatoria, mentre il miR-450b-5p potrebbe influenzare lo sviluppo corneale regolando il gene Pax6, essenziale per il normale sviluppo dell’occhio. L’esposizione a fattori ambientali come raggi UV e inquinanti può inoltre contribuire all’alterazione dei miRNA nelle lacrime, aggravando lo stress ossidativo a livello oculare. Nonostante questi risultati promettenti, sono necessari studi più ampi e standardizzati per confermare il ruolo dei miRNA nella diagnosi e nella gestione della DED, migliorando l’affidabilità e la riproducibilità dei dati raccolti.
Sindrome di Sjögren
La sindrome di Sjögren (SS) è una malattia autoimmune cronica caratterizzata dall’infiltrazione linfocitaria delle ghiandole esocrine, in particolare quelle salivari e lacrimali. Tuttavia, la sovrapposizione dei sintomi con altre malattie infiammatorie spesso ne ritarda la diagnosi e il trattamento. L’identificazione di biomarcatori lacrimali potrebbe migliorare la diagnosi precoce e prevenire errori gestionali. Uno studio recente ha evidenziato quattro miRNA sovraregolati e dieci sottoregolati nei pazienti con SS rispetto ai controlli sani. Molti di questi miRNA sono coinvolti nella regolazione dei processi infiammatori e della risposta immunitaria. In particolare, i miR-16 e miR-223 sono stati trovati aumentati nei tessuti delle ghiandole salivari e nelle cellule mononucleate del sangue, suggerendo un legame con la riduzione della secrezione salivare. Il miR-142-3p, invece, sembra essere trasportato dalle cellule T attivate alle ghiandole esocrine, alterando i segnali intracellulari coinvolti nella produzione di fluidi ed enzimi. Inoltre, l’aumento del miR-34a potrebbe essere correlato alla disfunzione delle cellule T CD4+ e CD8+, favorendo il danno delle ghiandole esocrine nei pazienti con SS. La riduzione del miR-92 è invece associata a una maggiore espressione di geni di difesa innata nella cornea, contribuendo all’infiammazione cronica. Infine, la famiglia dei miR-30, che regola negativamente il fattore di attivazione delle cellule B (BAFF), risulta sottoregolata, favorendo un’eccessiva proliferazione delle cellule B e un’attivazione autoimmune anomala. Questi risultati suggeriscono che i miRNA nelle lacrime potrebbero diventare biomarcatori utili per la diagnosi e il monitoraggio della SS, ma anche in questo caso sono necessari ulteriori studi per comprendere meglio il loro ruolo e sviluppare test clinici affidabili.
Retinopatia diabetica (DR) ed edema maculare diabetico (DME)
Sono stati identificati miRNA specifici, come i miR-214-3p e miR-218-5p, che mostrano livelli alterati nei pazienti con DR. Alcuni di questi miRNA sono coinvolti nella regolazione del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), suggerendo il loro potenziale ruolo nella patogenesi della neovascolarizzazione retinica.
Glaucoma
Recenti studi hanno analizzato il ruolo dei miRNA nelle lacrime di pazienti con POAG, evidenziando alterazioni significative rispetto ai controlli sani. Alcuni miRNA risultano aumentati nei pazienti con POAG, mentre altri appaiono ridotti. Tuttavia, i risultati variano tra gli studi, probabilmente a causa delle differenti metodologie di analisi utilizzate (RT-PCR mirata vs. RNA-Seq) e della variabilità dei gruppi di controllo. Alcuni di questi miRNA sono già noti per il loro ruolo nella patogenesi del glaucoma. Il miR-27a, ad esempio, sembra esercitare un effetto neuroprotettivo inibendo la sintesi della proteina pro-apoptotica Bcl-2, mentre il miR-125b è coinvolto nella degenerazione neuro-retinica indotta dall'attivazione della microglia. Il miR-146b, invece, agisce come regolatore negativo dell’infiammazione, modulando la via NF-κB, che risulta iperattivata nei pazienti con POAG. Inoltre, il miR-126 sarebbe associato alla regolazione della via VEGF-Notch, implicata nella sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche. La sua espressione risulta alterata nei modelli murini di glaucoma, suggerendo un possibile ruolo nel danno neurovascolare. Questi risultati indicano che i miRNA nelle lacrime potrebbero diventare biomarcatori innovativi per la diagnosi precoce e il monitoraggio del glaucoma, ma sono necessari ulteriori studi per validarne l'applicazione clinica.
Malattia di Alzheimer (AD)
Recenti studi hanno evidenziato alterazioni nella composizione e nel flusso lacrimale nei pazienti affetti, suggerendo un possibile legame tra i miRNA nelle lacrime e la malattia. Un’analisi del profilo dei miRNA nelle lacrime di pazienti con AD rispetto ai controlli sani ha identificato 90 miRNA con espressione alterata e 133 miRNA comuni tra i due gruppi. In particolare, il miR-200b-5p è stato individuato esclusivamente nei pazienti con Alzheimer, rendendolo un potenziale biomarcatore della malattia.
Il miR-200b/c è noto per il suo ruolo nella regolazione dell’accumulo di β-amiloide, una delle principali cause di danno neuronale nell’AD. Studi su modelli murini hanno mostrato che un aumento di miR-200b/c è associato alla riduzione della secrezione di β-amiloide e al miglioramento della memoria, mentre la sua espressione risulta ridotta nell’ippocampo di topi transgenici con AD.
La rilevazione dei miRNA nelle lacrime potrebbe rappresentare un'opportunità per sviluppare nuovi strumenti diagnostici non invasivi, oltre a offrire spunti per possibili approcci terapeutici mirati alla neuroprotezione. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per confermarne il come biomarcatori clinici affidabile.
Tumore mammario metastatico
Nonostante i progressi nella diagnosi e nel trattamento del tumore mammario metastatico, la sopravvivenza a 5 anni rimane bassa. La diagnosi precoce è cruciale per prevenire la progressione della malattia, e la ricerca di nuovi metodi diagnostici è in continua evoluzione. I miRNA sono ormai riconosciuti come elementi chiave nella regolazione dei processi tumorali, ma la loro analisi non invasiva è ancora limitata.
Uno studio recente ha rilevato livelli significativamente più alti di miR-21 e miR-200c negli esosomi lacrimali di pazienti con tumore mammario metastatico rispetto ai controlli sani. Questi miRNA erano stati selezionati in base a precedenti studi che ne avevano già evidenziato l’aumento nel plasma di pazienti con carcinoma metastatico rispetto a quelli con malattia localizzata. Un’analisi più ampia del profilo dei miRNA nelle lacrime potrebbe quindi individuare nuovi biomarcatori per la malattia.
Vantaggi della diagnostica basata sui miRNA nelle lacrime
L'analisi dei miRNA nelle lacrime offre numerosi vantaggi rispetto ai metodi diagnostici tradizionali: non invasività: la raccolta delle lacrime è semplice e indolore, rendendola ideale per screening ripetuti; elevata specificità: i profili di miRNA sono altamente specifici per ciascuna condizione patologica; possibilità di diagnosi precoce: alterazioni nei livelli di miRNA possono essere rilevate prima della comparsa dei sintomi clinici, facilitando l’intervento tempestivo.
Sfide e prospettive future
Nonostante il potenziale promettente, vi sono ancora alcune sfide da affrontare. In particolare, la variabilità individuale nei livelli di miRNA che richiede studi con una numerosità campionaria più ampia per validare i biomarcatori. La standardizzazione dei metodi di raccolta e analisi dei miRNA nelle lacrime è essenziale per garantire risultati affidabili e riproducibili, e l'integrazione dei profili di miRNA con altre tecnologie diagnostiche, come la spettroscopia e l'intelligenza artificiale, potrebbe migliorare ulteriormente la precisione diagnostica. In conclusione, i microRNA nelle lacrime rappresentano una nuova ed entusiasmante frontiera nella diagnostica oculare. La loro analisi potrebbe presto offrire al medico oculista uno strumento innovativo per individuare precocemente alterazioni patologiche, anche in assenza di sintomi evidenti, persino prima che questi si manifestino. Tuttavia, siamo ancora agli inizi di questa rivoluzione scientifica: la ricerca in questo campo deve affrontare sfide importanti, come la necessità di stabilire un profilo di riferimento dei miRNA nelle lacrime umane e di standardizzare i metodi di analisi per ottenere dati affidabili e riproducibili. Infatti, ogni individuo ha un profilo unico di miRNA, che può variare nel tempo e in risposta a diversi fattori ambientali e patologici. Questo rende complesso il loro utilizzo come biomarcatori universali, ma allo stesso tempo apre nuove strade per una medicina sempre più personalizzata. Per rendere questa prospettiva una realtà clinica, sarà fondamentale promuovere studi su larga scala, migliorare le tecniche di campionamento e analisi e sviluppare sistemi di condivisione dei dati tra i ricercatori. Immaginiamo un futuro in cui un semplice test sulle lacrime possa rivelare precocemente il rischio di sviluppare una malattia, permettendo di intervenire tempestivamente e migliorare la qualità della vita dei pazienti. La ricerca in questo campo è in rapida evoluzione e potrebbe rivoluzionare l’approccio alla medicina personalizzata, integrando l’oftalmologia in un contesto diagnostico più ampio e multidisciplinare. Questo scenario non è più fantascienza, ma un obiettivo concreto che la ricerca scientifica sta cercando di raggiungere.
Gli autori dichiarano l’assenza di conflitti di interesse.
